Résumé de l'analyse DE RNA-Seq 2

RNA-Seq avec Bioconductor en R

Mary Piper

Bioinformatics Consultant and Trainer

Workflow DESeq – normalisation

workflow-normalization

dds <- estimateSizeFactors(dds)
normalized_counts <- counts(dds, normalized=TRUE)
RNA-Seq avec Bioconductor en R

Analyses de clustering non supervisé : transformation log

workflow-clustering

# Transformation logarithmique des comptes normalisés
vsd <- vst(dds, blind=TRUE)
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Analyses de clustering non supervisé

heatmap

RNA-Seq avec Bioconductor en R

Analyses de clustering non supervisé – heatmap

vsd %>%
    assay() %>% # Extraire la matrice vst de l'objet
    cor() %>%   # Calculer les corrélations par paires
    pheatmap(annotation = metadata[ , c("column_name1", "column_name2])

heatmap

RNA-Seq avec Bioconductor en R

Analyses de clustering non supervisé – PCA

# ACP
plotPCA(vsd, intgroup="condition")

pca

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Lancer l'analyse DE

DESeq2 workflow - model

RNA-Seq avec Bioconductor en R

Lancer l'analyse DE

# Créer l'objet DESeq
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = rawcounts,
                              colData = metadata,
                              design = ~ source_of_variation + condition)

# Exécuter l'analyse
dds <- DESeq(dds)
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Workflow DESeq2 – modèle

# Tracer les estimations de dispersion
plotDispEsts(dds)

dispersion

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Workflow DESeq2 – contrastes et réduction des LFC

DESeq2 workflow - LFC shrinkage

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Workflow DESeq2 – contrastes et réduction des LFC

# Extraire les résultats pour la comparaison d'intérêt
res <- results(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                alpha = 0.05)

# Réduire les log2 fold changes
res <- lfcShrink(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                res = res)
RNA-Seq avec Bioconductor en R

Workflow DESeq2 – réduction des LFC

# Extraire tous les résultats en data frame
res_all <- data.frame(res) %>% 
        rownames_to_column(var = "ensgene") 
# Ajouter les annotations de gènes
res_all <- left_join(x = res_all, 
                    y = grcm38[, c("ensgene", "symbol", "description")], 
                    by = "ensgene") 
res_all <- arrange(res_all, padj)

annotations

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Workflow DESeq2 – exploration des résultats

DESeq2 workflow - results exploration

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Workflow DESeq2 – exploration des résultats

# Identifier les gènes significatifs
res_sig <- subset(res_all, padj < 0.05)

sig results

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Passons à la pratique !

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