RNA-Seq DE 분석 요약 2

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

Mary Piper

Bioinformatics Consultant and Trainer

DESeq 워크플로 - 정규화

워크플로-정규화

dds <- estimateSizeFactors(dds)
normalized_counts <- counts(dds, normalized=TRUE)
R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

비지도 클러스터링 분석: 로그 변환

워크플로-클러스터링

# Log transformation of normalized counts
vsd <- vst(dds, blind=TRUE)
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비지도 클러스터링 분석

히트맵

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

비지도 클러스터링 분석 - 히트맵

vsd %>%
    assay() %>% # Extract the vst matrix from the object
    cor() %>%   # Compute pairwise correlation values
    pheatmap(annotation = metadata[ , c("column_name1", "column_name2])

히트맵

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

비지도 클러스터링 분석 - PCA

# PCA
plotPCA(vsd, intgroup="condition")

pca

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DE 분석 실행

DESeq2 워크플로 - 모델

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

DE 분석 실행

# Create DESeq object
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = rawcounts,
                              colData = metadata,
                              design = ~ source_of_variation + condition)

# Run analysis
dds <- DESeq(dds)
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DESeq2 워크플로 - 모델

# Plot dispersion estimates
plotDispEsts(dds)

분산 추정

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DESeq2 워크플로 - 대비 및 LFC 축소

DESeq2 워크플로 - LFC 축소

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

DESeq2 워크플로 - 대비 및 LFC 축소

# Extract results for comparison of interest
res <- results(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                alpha = 0.05)

# Shrink the log2 foldchanges
res <- lfcShrink(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                res = res)
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DESeq2 워크플로 - LFC 축소

# Extract all results as a data frame
res_all <- data.frame(res) %>% 
        rownames_to_column(var = "ensgene") 
# Add gene annotations
res_all <- left_join(x = res_all, 
                    y = grcm38[, c("ensgene", "symbol", "description")], 
                    by = "ensgene") 
res_all <- arrange(res_all, padj)

주석

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

DESeq2 워크플로 - 결과 탐색

DESeq2 워크플로 - 결과 탐색

R로 하는 Bioconductor 기반 RNA-Seq

DESeq2 워크플로 - 결과 탐색

# Identify significant genes
res_sig <- subset(res_all, padj < 0.05)

유의한 결과

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mutiple_viz.png

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연습해 봅시다!

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