RNA-Seq DE分析サマリー 2

RNA-Seq with Bioconductor in R

Mary Piper

Bioinformatics Consultant and Trainer

DESeqワークフロー - 正規化

ワークフロー - 正規化

dds <- estimateSizeFactors(dds)
normalized_counts <- counts(dds, normalized=TRUE)

教師なしクラスタリング分析：対数変換

ワークフロー - クラスタリング

# Log transformation of normalized counts
vsd <- vst(dds, blind=TRUE)

教師なしクラスタリング分析

ヒートマップ

教師なしクラスタリング分析 - ヒートマップ

vsd %>%
    assay() %>% # Extract the vst matrix from the object
    cor() %>%   # Compute pairwise correlation values
    pheatmap(annotation = metadata[ , c("column_name1", "column_name2])

ヒートマップ

教師なしクラスタリング分析 - PCA

# PCA
plotPCA(vsd, intgroup="condition")

PCA

DE分析の実行

DESeq2ワークフロー - モデル

DE分析の実行

# Create DESeq object
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = rawcounts,
                              colData = metadata,
                              design = ~ source_of_variation + condition)

# Run analysis
dds <- DESeq(dds)

DESeq2ワークフロー - モデル

# Plot dispersion estimates
plotDispEsts(dds)

分散推定値

DESeq2ワークフロー - コントラストとLFC縮小

DESeq2ワークフロー - LFC縮小

DESeq2ワークフロー - コントラストとLFC縮小

# Extract results for comparison of interest
res <- results(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                alpha = 0.05)

# Shrink the log2 foldchanges
res <- lfcShrink(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                res = res)

DESeq2ワークフロー - LFC縮小

# Extract all results as a data frame
res_all <- data.frame(res) %>% 
        rownames_to_column(var = "ensgene") 
# Add gene annotations
res_all <- left_join(x = res_all, 
                    y = grcm38[, c("ensgene", "symbol", "description")], 
                    by = "ensgene") 
res_all <- arrange(res_all, padj)

アノテーション

DESeq2ワークフロー - 結果の探索

# Identify significant genes
res_sig <- subset(res_all, padj < 0.05)

有意な結果

では、練習しましょう！

RNA-Seq with Bioconductor in R