RNA-Seq DE analiz özeti 2

R ile Bioconductor kullanarak RNA-Seq

Mary Piper

Bioinformatics Consultant and Trainer

DESeq iş akışı - normalizasyon

iş akışı-normalizasyon

dds <- estimateSizeFactors(dds)
normalized_counts <- counts(dds, normalized=TRUE)

Güdümsüz kümeleme analizleri: log dönüşümü

iş akışı-kümeleme

# Normalleştirilmiş sayımların log dönüşümü
vsd <- vst(dds, blind=TRUE)

Güdümsüz kümeleme analizleri

ısı haritası

Güdümsüz kümeleme analizleri - ısı haritası

vsd %>%
    assay() %>% # Nesneden vst matrisini çıkar
    cor() %>%   # Çiftler arası korelasyonları hesapla
    pheatmap(annotation = metadata[ , c("column_name1", "column_name2])

ısı haritası

Güdümsüz kümeleme analizleri - PCA

# PCA
plotPCA(vsd, intgroup="condition")

pca

DE analizini çalıştırma

DESeq2 iş akışı - model

DE analizini çalıştırma

# DESeq nesnesi oluştur
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = rawcounts,
                              colData = metadata,
                              design = ~ source_of_variation + condition)

# Analizi çalıştır
dds <- DESeq(dds)

DESeq2 iş akışı - model

# Saçılım kestirimlerini çiz
plotDispEsts(dds)

saçılım

DESeq2 iş akışı - karşıtlıklar ve LFC küçültme

DESeq2 iş akışı - LFC küçültme

DESeq2 iş akışı - karşıtlıklar ve LFC küçültme

# İlgili karşılaştırmanın sonuçlarını çıkar
res <- results(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                alpha = 0.05)

# log2 kat değişimlerini küçült
res <- lfcShrink(dds, 
                contrast = c("condition_factor", "level_to_compare", 
                "base_level"), 
                res = res)

DESeq2 iş akışı - LFC küçültme

# Tüm sonuçları bir veri çerçevesi olarak çıkar
res_all <- data.frame(res) %>% 
        rownames_to_column(var = "ensgene") 
# Gen ek açıklamalarını ekle
res_all <- left_join(x = res_all, 
                    y = grcm38[, c("ensgene", "symbol", "description")], 
                    by = "ensgene") 
res_all <- arrange(res_all, padj)

ek açıklamalar

DESeq2 iş akışı - sonuçları keşfetme

# Anlamlı genleri belirle
res_sig <- subset(res_all, padj < 0.05)

anlamlı sonuçlar

çoklu_görselleştirme.png

Hadi pratik yapalım!

R ile Bioconductor kullanarak RNA-Seq